Mantenimiento y crioconservación de la línea celular tumoral A549

El cultivo de tejidos se ha sido considerado inicialmente como una técnica difícil de aprender. Aunque en el presente, estas dificultades se han superado gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas, etc. 

A continuación, presentaré una forma fácil para aprender a mantener y crioconservar la línea celular tumoral humana A549 proveniente de pulmón, empleando técnicas de cultivos celulares, y colaborar con el correcto funcionamiento del laboratorio.

·         Introducción:

Al establecer un cultivo celular se seleccionan las células que van a crecer en función de numerosos criterios: sólo formarán parte del cultivo aquellas células que sean capaces de superar el proceso de disgregación, de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en monocapa, bien en suspensión). Crecer en monocapa significa que las células se adhieren al sustrato y en esta forma inician la proliferación. Cuando se mantiene un cultivo se establece una nueva selección: aumentan el número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. Al alcanzar la confluencia en el cultivo, se pueden observar muchas líneas celulares expresando sus aspectos más característicos en cuanto su morfología y fisiología son más parecidas a su estado original..

Las aplicaciones de los cultivos celulares pueden ser tanto en la investigación básica como en la aplicada. En la investigación básica, permiten estudiar fenómenos complejos, entre las aplicaciones más importantes: la actividad intracelular (transcripción de ADN, metabolismo energético), el flujo intracelular de biomoléculas (procesamiento del ARN), Genómica, Virología, Biotecnología y ecología celular.

Así mismo el manejo in vito de células presenta   ventajas las más importantes son: que permiten un control preciso y fino del medio ambiente, una caracterización y homogeneidad de la muestra celular y el bajo costo económico. 

Por otra parte, las desventajas del mantenimiento de una línea celular se dan por que es una técnica sensible, también la cantidad y la inestabilidad genómica que muchas células tienen, conlleva que afecte su velocidad de crecimiento como su capacidad de diferenciarse.

En nuestro proyecto hemos trabajado con la línea celular tumoral humana A549  las cuales son células alveolares de cáncer basales epiteliales de humanos. Esta línea celular fue desarrollada por primera vez en 1972 por DJ Giard, et al. A través de la extracción y cultivo de tejido pulmonar canceroso de un hombre caucásico de 58 años.

En la naturaleza, estas células son escamosas y responsables de la difusión de algunas sustancias, tales como agua y electrolitos, a través de los alvéolos de los pulmones. Si estas se cultivan in vitro, crecen como células en monocapa adherente.

Dentro del mantenimiento de una línea celular es indispensable su crioconservación con el objetivo de crear bancos de células las cuales se utilizaran dependiendo de interés científico, es así que como parte de mis objetivos fue aprender la técnica de crioconservación de la línea celular A- 549.

La palabra griega "cryo" significa frío. La criobiología es la ciencia que estudia la preservación de los materiales biológicos enfriándolos a temperaturas criogénicas. Su objetivo principal, es la conservación de células vivas mediante la utilización de las bajas temperaturas, frenando los procesos,  envejecimiento y degeneración celular, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula. Generalmente las células son congeladas entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. (Loyzaga 2011)

En farmacología y Toxicología se emplean ampliamente los modelos basados en la reactividad de las células aisladas. (Loyzaga 2011)

Y aunque si bien las células después de haber sido descongeladas en el laboratorio, deben sobrevivir a un ambiente artificial en la caja, este debe ser estéril y sobre todo debe proporcionar a las células un ambiente adecuado con los siguientes factores: el primero que es la temperatura, como si fuese el mismo cuerpo humano donde estas se encuentran, el factor de espacio: la caja no debe contener demasiadas células y finalmenteel factor principal: poseer los nutrientes necesarios en el medio suplementado, para que solo de esta forma las células puedan crecer normalmente y evadir el comúnmente denominado“estrés celular” y sobre todo puedan sobrevivir.

·         Materiales y Metodología:

Cámara  de Flujo Laminar: Usadas para preparar productos estériles que no casan daño alguno al operador y productos (Delgado & Díaz 2005)

Tripsina: Sirve para desasociar células por métodos químicos, La reacción de la tripsinización se debe parar luego de dos o tres minutos con la adición  inhibidor de tripsina inmediatamente. (Fernández 1997) para evitar el estrés célular.

PBS: Es uno de los buffers más utilizados porque es isotónico y no tóxico para las células. Se utiliza para diluir sustancias utilizadas para el cultivo y para lavar los recipientes que contienen células.

Cámara de Neubauer (Hematocitómetro Muchos experimentos biomédicos requieren la manipulación de una cantidad conocida de células, con el fin de lograr datos precisos, reproducibles, y estadísticamente relevante. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica particularmente esencial para cualquier científico biomédico. La forma más común para contar las células es mediante el uso de un hemocitómetro - un instrumento que lleva dos rejillas grabadas con láser, que ayudan en la enumeración de las células de una alícuota bajo un microscopio.

Frasco de cultivo de Roux: Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión.

El azul de tripano: se usa comúnmente como colorante en microscopía (para el recuento de células).

El medio por el cual las células se encuentran dentro y  por ende crecen y dividen se conoce como “medio suplementado”. Su composición de solución química no comprende en su totalidad un medio basal, sino que este suele ser suplementado con otras sustancias clave, entre ellas:

Aminoácidos esenciales, un suplemento común de aminoácido es la conocidaL glutamina,  aunque inestable en el medio se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado. La usamos en una concentración del 1%.

Hormonas y factores de crecimiento: suero fetal bobino ("fetal bovine serum FBS) que es usado en líneas más exigentes. Este suero tiene la propiedad química de inhibir la tripsina. La usamos en una concentración del 10%.

Se añaden inhibidores del crecimiento de los contaminantes: antibiótico- antimicótico. (En el laboratorio de la UTPL, se suele suministrarlocuando preparan el medio basal). Su concentración es del 1% para ser usado.

Condiciones de cultivo.

Las línea celular fue cultivada en medio base RPMI-1640 (GIBCO) suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% (GIBCO), antibiótico-antimicótico (100 Unidades/ml de Penicilina G, 100 µg/ml de sulfato de Estreptomicina y 0,25 µg/ml de Amphotericina B como Funfizona) (GIBCO), 2 mM de L-glutamina (GIBCO), Bicarbonato de sodio al 0,2% (MERCK). Los cultivos celulares se mantuvieron en incubación a 37°C de Temperatura en una atmósfera humidificada al 5% de CO2.

Un parámetro adicional que nos permite conocer el crecimiento de nuestra línea celular es observar  el viraje del color del medio, ya que se sabe que cuando las células no crecen, el medio no se consume y permanece en su color original rosa intenso, por otra parte se ha comprobado que cuando las células están creciendo normalmente el medio tiende a acidificarse tomando un color durazno o amarillo.

Descongelar las células:

Antes de iniciar cualquier operación el laboratorio,  se acondiciona el área de trabajo. Esto significa que la cabina de flujo laminar previamente debe haber estado con UV durante 15 minutos y otros 15 minutos con flujo de aire.

En una caja de 25 cm²,colocamos 3ml de medio suplementado. Retiramos los criotubos del depósito de nitrógeno líquido serán transportados de forma inmediata a un baño térmico a 37ºC, procurando que la parte superior no quede sumergida enel mismo.

Cuando su contenido se encuentre en un estado líquido en más o menos de 3-4 minutos, volteamos el contenido del criotubo dentro del frasco de cultivo 25 cm², y procedemos a homogenizar con movimientos ascendentes con el fin que las células se distribuyan por toda la superficie.

Una vez que las células estén en el frasco de cultivo, se comprobará el resultado de la siembra mediante observación en un microscopio invertido.

 Transcurridas dos horas, se procederá a realizar el cambio de medio de cultivo

Cálculos previos para el mantenimiento celular:     

Previó a cualquier ensayo a realizarse con cultivos celulares se debe llevar una planificación  para saber el número aproximado de células que vamos a necesitar para lo cual se revisa la información de la línea celular y constatamos el periodo de réplica lo cual va sujeto al área de cultivo, es así como  obtendremos una relación entre el número de células que necesitamos y el área del frasco de cultivo.

Para llegar a proceder con nuestros cálculos, necesitamos saber cuántas células entran dentro de nuestros materiales de trabajo, uno de estos es llamado “crio vial” (tubo en que se congelan las células) en donde entran aproximadamente 1’200.000 células.  En un frasco Roux (botella donde crecen las células es suspensión) entran 7’500.000 células como máximo. La tasa de crecimiento celular es logarítmica y se da cada 24 horas, es así que planificamos el número inicial de nuestro cultivo.

Mantenimiento celular:     

1.        Una vez que todos nuestros materiales mencionados y nuestro lugar de trabajo se encuentra estériles, introducimos estos frascos limpiándolos con alcohol para no dejar introducir agentes externos a la cámara de flujo laminar.

2.        Tomamos la caja de cultivo que ya tiene las células descongeladas y la introducimos limpiándola con alcohol exteriormente.

3.        Eliminamos de la caja el medio consumido y ponemos 5ml de PBS así “lavamos la caja”.

4.        Eliminamos el PBS con la bomba  de vacío succionándolo para dejar la caja vacía y agregamos 500 µl de tripsina, dejando que actúe  durante 2 minutos.

5.        Para inhibir la tripsina usamos medio suplementado (siempre la cantidad de medio suplementado debe doblar a la cantidad que se usó en tripsina para que esta enzima deje de actuar)

6.        Pasamos la suspensión celular  a un tubo Corning para centrífuga durante cinco minutos a 1500 rpm.

7.        Durante este periodo de centrifuga preparo el material que voy a utilizar como es el hemocitometro con el cual realizaremos el recuento celular, este debe estar en buenas condiciones y se lo debe limpiar siempre antes de cada uso.

8.        Luego retiramos nuestro tubo para eliminar el sobre nadante y mantener el pellet, debemos aspirar con cuidado el sobrenadante teniendo cuidado de no perder  el pellet, seguido resuspendemos el pellet con 1ml de medio suplementado y homogenizamos.

9.     La cuantificación del número de células por mililitro se realizó mediante el método de exclusión con azul de tripano, contando en la cámara de Neubaüer  5 campos. Se calculó el número de células mediante la aplicación de la siguiente fórmula:

La finalidad de esto es responder a la pregunta ¿Cuánto es el número de células viables por ml?

10.  Cuando inserte en el microscopio este Hemocitómetro, usar un acercamiento [40X Filtro 1 (ph1)]. Nótese que son 2 espacios de almacenamiento distintos los que tiene la cámara de Neubauer, cada uno comprende de nueve cuadrantes y solo se cuentan las células en los cinco espacios marcados en el presente gráfico:

11. Una vez contados las células de los cinco espacios de los dos compartimientos del Hemocitómetro, se saca una media de estas.

¿Cuántas células hay en el Hemocitómetro?

Mi media fue 156.5, mi factor de dilución 50 y dividido para los cinco cuadrantes obtuve 1565 que al multiplicarlo por 10.000 (volumen del diámetro de la cámara de Neubauer) me dio igual a 15’650.000 células en el Hemocitómetro.

Ecuación final para saber cuántos µl necesito sacar:

Para saber ¿cuántos ml debo sacar del tubo Corning hacia mi caja? se aplica la siguiente fórmula:

·         Resultados Y Discusión:

Aprender que las células crecen logarítmicamente. Observando su morfología correcta y verificando la confluencia de crecimiento, reconocer si mi cultivo se encuentra en buenas condiciones, mantenerlo libre de hongos y levaduras, así mismo pude diferencia la apariencia celular cuando estas se encontraban en buen estado y cuando estas se encuentran en condiciones de estrés como por ejemplo por falta de nutrientes. Así mismo puedo reconocer  si es necesario o no subcultivar, así como habrá días en los que solamente se requiera cambiar el medio cultivo. En casos que no se cambie el medio las células a tiempo o pertinentemente  pueden estresarse y por consecuencia la tasa de crecimiento no será normal.

Finalmente pude colaborar con un incremento de 5 nuevos crioviales que contienen células A 549 para el banco de células del laboratorio, así como he aprendido la importancia de un adecuado uso de los materiales, reactivos y equipos que se emplean para estas técnicas in vitro

Conclusiones

Todas las líneas celulares son propensas a estresarse o contaminarse para lo cual debemos evitar el mal uso de los reactivos y equipos, se debe llevar un control diario de la morfología de las células, antes de iniciar el trabajo se debe constatar que se cuente con el material necesario así como estar seguro de entender las técnicas y los cálculos necesarios para un buen trabajo.

·         Bibliografía

Castillo, G. (ed.). 2004. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA, México. 91 pp

Delgado López, N, Díaz, J. 2005. Fundamentos de nutrición parenteral. Ed. Médica Internacional LTDA. 9589181929. Colombia. 106 pp

Fernández Canales, M. (ed.). 1997. Procesos de transmodulación en el sistema nervioso, estudios "in vitro" e "in vivo". Ediciones de la Universidad de Castilla-La Mancha, España. 58 pp

Laboratorio de senacsa. 2001. Manual de técnicas de laboratorio para el diagnóstico en salud animal. Tomo I · SENACSA,IICA, Paraguay. 57 pp

Loyzaga, G. 2011. Cátedra innovación y Salud. Fundación FG-UCM.

Tapirus Kabomani, nueva especie en la Amazonia.

Una nueva especie de tapir de la Amazonia.

Recientemente leí una publicación por el "American Society Of Mamalogist" que no tiene más de dos semanas de haber sido publicada, se trata sobre el descubrimiento de un nuevo Tapir, lo que algunos le han llamado "el descubrimiento zoológico más grande de las últimas dos décadas", 

Lo he traducido al español, aumentado información básica sobre los tapires en general y colocado fotografías que fueron y no usadas en la publicación original, todo esto para hacerlo más fácil de comprender. 

Finalmente incluyo el análisis molecular y tiempos de divergencia pertenecientes a la metodología para aquellos que deseen saber más del tema fuera de las diapositivas que yo mismo realicé. 

Metodología y Materiales.

Se realizó un análisis cladístico morfológico utilizando la versión TNT 1.1 para inferir en las relaciones filogenéticas de los tapires utilizando la parsimonia con la aquickie.run, proporcionados con el paquete de TNT.

La matriz incluyó 15 taxones y 60 caracteres craneales, dentales y postcraneanos, modificado a partir de Hulbert y Wallace con personajes tratados como no ordenada.

 El grupo-incluido todas las especies vivientes conocidas y 6 fósil Tapirus del Mioceno al Pleistoceno del Norte y del Sur. Out-grupos incluyen los géneros extintos Plesiotapirus y Paratapirus, siguiendo las propuestas anteriores.

Análisis Moleculares

Los siguientes números totales de las muestras o secuencias, o ambos, se incluyeron en los análisis:

T. terrestris: n = 52, T. bairdii: n = 3, T. pinchaque: n = 5, T. indicus: n = 4, Tapirus sp. noviembre: n = 4. 

Equus caballus o Rhinocerotidae, o ambos, se utilizaron como "out-groups"

Las secuencias de ADN de 3 genes de ADN mitocondrial (citocromo b [Cytb], citocromo oxidasa I [COI], y citocromo oxidasa II [CO II]) de las especies de Tapirus que viven, se generaron y se compararon con los datos publicados anteriormente (Ashley et al 1996;. Normandos y Ashley 2000;. de Thoisy et al 2010).

Se incluyó un análisis exhaustivo de la Cytb en un gran muestreo geográfica en América del Sur, como se ha demostrado ser útil en la recuperación de la filogenia de los mamíferos y la exposición de las especies crípticas (Baker y Bradley 2006;. Redondo et al 2008).

Los alineamientos de secuencias se realizaron con Clustal W 2.1 (Larkin et al. 2007) y editarse o concatenados, o ambos, cuando sea necesario con la función de alineación Explorador implementado en MEGA 5.1

Las alineaciones resultantes se utilizaron en la reconstrucción filogenética por 2 métodos. En primer lugar, se realizó una búsqueda de máxima probabilidad en PhyML 3.0.1 (Guindon et al. 2010) utilizando el modelo de GTRþCþinv con parámetros estimados a partir de los datos por el enfoque de máxima probabilidad. El árbol inicial era un árbol BioNJ y se realizó la búsqueda utilizando tanto NNI y reordenamientos SPR en cada interacción manteniendo sólo el árbol con mejor puntuación verosimilitud.

Utilizaron como probabilidades previas para las edades de los nodos (Drummond y Rambaut 2006). También utilizamos un modelo de reloj estricta y sin restricciones en los tiempos de divergencia de los nodos, con la tasa de evolución descrito anteriormente (2,5%). Todas las estimaciones fueron congruentes.

Tiempos de Divergencia

Se utilizaron dos métodos para estimar los tiempos de divergencia entre los linajes Tapirus. En el primero, se utilizó el método de Linetree Takezaki-Rzhetsky-Nei (Tamura et al. 2007), lo que supone un estricto reloj molecular. Se Asumimó una tasa de sustitución evolutiva de 2,5% por millón de años.

Además se usó fechas estimadas a partir del registro fósil para calibrar el reloj molecular y establecer límites en algunas de las divisiones clado en el árbol para refinar las estimaciones (véase Hulbert 1999 ; Spassov y Ginsburg 1999 ; Holanda y Cozzuol 2006 ; Ferrero y Noriega 2007 ; Holanda et al 2011 ;  y el análisis morfológico a continuación) . Estos límites de edad determinados por fechas fósiles se establecieron en la división entre los tapires asiáticos y americanos (hace 15 6 SD 5.000.000 años [ mya ] ) , por la divergencia entre T. bairdii y los tapires sudamericanos ( 7.5 6 1 mya ) , así como la diversificación de los tapires Sudamericanos ( 0,13 6 0,1 mya ) . En un segundo método , se utilizó una estimación bayesiana implementado en BESTIA 1.5.3 ( Drummond et al . 2007 ) , con un reloj molecular relajado utilizando las mismas calibraciones fósiles arriba para ajustar los medios y las desviaciones estándar de una distribución normal utilizado como probabilidades previas para las edades de los nodos ( Drummond y Rambaut 2006 ) . También utilizamos un modelo de reloj estricta y sin restricciones en los tiempos de divergencia de los nodos , con la tasa de evolución descrito anteriormente ( 2,5 %). Todas las estimaciones fueron congruentes.

Pan kun va al médico, El mejor Humor Animal.

Hace poco me he enterado de este programa muy interesante sobre un chimpancé y su fiel amigo canino.

El programa se fundamenta en que el que estos animales protagonistas se desenvuelven en varias actividades del ámbito humano, dejando al público perplejo ante la inteligencia de Pan (el chimpancé).

Aquí encontraran un video con tan solo un segmento de un capítulo en donde Pan Kun va al médico.


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Biomecánica de tres cáctus columnares de América Latina.

Hola a todos los lectores de mi blog, rápidamente les comento que el presente artículo ha tenido como finalidad comentarles sobre la integridad de las ramificaciones de tres tipos de cactáceas. 

Sabiendo que es un tema completamente nuevo y no muy estudiado, me he he tomado mi tiempo en resumir las características más importantes de tres especies de cactus como también traducir y tomar las partes más importantes de un estudio científico de biomecánica que recientemente fue publicado y me gustó mucho, también con la finalidad de ahorrarles el tiempo especialmente a los que no sepan inglés.

Los autores de la publicación original en la que me he basado son: Hannes Schwager, Tom Masselter, Thomas Speck y Christoph Neinhuis en el año 2013, su publicación: Functional morphology and biomechanicsof branch–stem junctions in columnar cacti.

Ensayo Científico de ámbito biológico realizado por: Jaramillo Juan

Biomecánica de las ramificaciones en los cactus columnares: Pilosocereus pachycladus, Cleistocactus morawetzianus y Myrtillocactus geometrizans, como una estrategia de adaptación morfológica funcional.

Pilosocereus pachycladus es una especie fanerógama perteneciente a la familia Cactaceae, endémica de Brasil. Es una especie extendida por todo el mundo.

•Reino: Plantae •Subreino•Tracheobionta•Familia:•Cactaceae•Género:Pilosocereus •Especie: P. pachycladus

Cleistocactus morawetzianus es una especie de Cactus endémico de Perú, extendida por todo el mundo. Puede tener una altura de 45 a 60 cm.

•Reino: Plantae•Subreino:•Magnoliophyta•Familia•Cactaceae•Género:Cleistocactus•Especie: C.morawetzianus

Myrtillocactus geometrizans es una especie fanerógama perteneciente a la familia de las Cactaceae, endémica de México extendida por todo el mundo.

•Reino: Plantae•Subreino:•Magnoliophyta•Familia:•Cactaceae•Género:Myrtillocactus•Especie: M. geometrizans

v  Introducción:

A partir de la adaptación en ambientes áridos o semiáridos, las cactáceas columnares evolucionaron de manera diferente de la mayoría de las plantas dicotiledóneas. Las dos características morfológicas más conspicuas son las espinas usando areolas  y su suculenta corteza (Mauseth et al 2002).

En contraste con el principio de construcción ampliamente aceptado que indica que “los tejidos de soporte deben acomodarse en una periferia erecta columnar o estructura tubular para incrementar la rigidez a la flexión y la seguridad contra el doblo mediante el aumento del respectivo segundo momento del área axial” (Klein B. 2005) contrasta con el hecho que el tejido lignificado vascular (de apoyo) de los brotes del cactus, están localizados más centradamente.

Tejidos corticales suculentos para el almacenamiento de agua, la asimilación y transpiración, rodean a un tubo de tejido conductor y fibras. (Mauseth JD. 2006) FIGURA 1 D-F

La distinta constricción de las ramificaciones de cactus es en los puntos de ramificación debido a la presencia de la corteza suculenta, ésta es otra peculiaridad morfológica de los cactus columnares y no ha sido objeto de análisis biomecánicos todavía. Las averiguaciones previas sobre la estabilidad de ramificaciones de las plantas se centraron principalmente en las ramificaciones del árbol que no muestran estas constricciones. (Hannes S 2013)

Para estas ramificaciones "normales", el consenso principal es que las estrategias de adaptación de carga específicos conducen a condiciones de tensión-deformación homogénea en la región de ramificación. Típicamente el diámetro basal de una rama de árbol se correlaciona con la de flexión causada por la acción de su peso muerto y las cargas adicionales de viento  (Niklas KJ. 1992)

El objetivo de este estudio es analizar la estabilidad y la integridad de ramificaciones en tres especies de cactus columnar. Un enfoque especial es en la interacción mecánica entre la disposición de fibra interior del tejido vascular en combinación con la presencia de la corteza suculenta y la forma de la unión. Los resultados sugieren una grande estrategia de adaptación de cactus específica.

Figura 1. Pilosocereus pachycladus: (a) planta entera; (d) sección transversal de una rama; (g) Sección transversal de madera (j) madera en la sección tangencial longitudinal. Cleistocactus morawetzianus: (b) toda la planta, (e) la sección transversal de una rama, (h) sección transversal de la madera, (k) sección tangencial longitudinal de la madera. Myrtillocactus geometrizans: (c) toda la planta, (f) la sección transversal de una rama, (i) sección transversal de la madera, (l) la sección tangencial longitudinal de la madera.

S = piel, c = corteza, vt = tejidos lignificados vasculares (madera de cactus), p = médula (tuétano), fl = láminas de fibra; v = vaso.

v  Desarrollo:

Para los estudios macroscópicos, los especímenes fueron disecados manualmente y los tejidos lignificados de las ramificaciones se prepararon por maceración enzimática de celulosa y pectinasa a 378C. La Solución de la enzima en sí tamponada con ácido cítrico (pH 5,5), estabilizado con polivinilpirrolidona y conservado con azida de sodio. El curso de la fibra en la zona de ramificación se determinó mediante el análisis de vistas laterales macroscópicas, secciones longitudinales y transversales mediana con el procesamiento digital de imágenes de software ImageJ v 1.47t

Tres modelos informáticos tridimensionales de las ramificaciones de cactus se han generado con el software de modelado de elementos finitos PATRAN v. 2012 (MSC Software Corp.).

Los resultados de las investigaciones anatómicas y mecánicas descritas sirven como parámetros de entrada para estos modelos. Una particular atención se dio para representar correctamente las características morfológicas y anatómicas de las especies investigadas.

Figura 2: .Pilosocereus pachycladus: (a, d, g, j). Cleistocactus morawetzianus (b, e, h, k) Myrtillocactus geometrizans (c, f, i, l).

Los modelos con del material ortótropos e isótropo constantemente se utilizaron para poner de relieve la influencia de la madera fibrosa en el estado de tensión en la zona de ramificación. El resultado de estas simulaciones (P. pachycladus: figura 4e, i; M. geometrizans: figure 4f, j) se compararon con un modelo de referencia simple que consiste en dos tubos cilíndricos conjuntos (figura 4c, g) así como un modelo optimizado biomiméticamente usando de las reglas de diseño establecidas por Mattheck para  imitar ramificaciones de árbol (figura 4d, h)

Figura 4. Análisis de elementos finitos de los modelos de ramificación. Modelos de elementos finitos enteros de (a) pachycladus Pilosocereus y (b) Myrtillocactus geometrizans. Distribución de tensiones en el tejido vascular: tensiones de tracción (rojo) en el lado adaxial (c-f) y tensiones de compresión (azul) en el lado abaxial (g-j) de la ramificación de (c, g) un modelo de referencia que consiste en dos tubos cilíndricos conjuntas; (d, h) un modelo de acuerdo con los métodos desarrollados por Mattheck. (e, i) son el modelo de P. pachycladus, y (f, j) el modelo de M. geometrizans. Distribución de la tensión de compresión (azul) en la corteza suculenta: (k) el modelo de P. pachycladus; (l) el modelo de M. geometrizans. Flechas: (c, g) el estrés máximos; (e, f) desplazamiento lateral de la tensión acentos máximos; (i) desplazamiento lateral de la compresión de estrés máximos; (k, l) la tensión de compresión en la corteza en el lado abaxial de la ramificación.

Modelo de Referencia.- El modelo de referencia de dos tubos cilíndricos conjuntas muestra la distribución de la tensión típica de una viga en voladizo en condiciones de carga automática (figura 4c, g). Los esfuerzos de tensión en la adaxial y tensiones de compresión en el lado abaxial de la rama alcanzar su máximos en la unión de la rama con el vástago. El borde afilado en la transición conduce a una concentración muy alta tensión (tensiones de primera clase, las flechas en la figura 4c, g), lo que aumenta el riesgo de fracaso.

Modelo de Mattheck.- En un modelo basado en las reglas de diseño propuestos por Mattheck, las tensiones mecánicas en la zona de unión se extienden por un área mayor (véase la figura 4d, h con la figura 4c, g). El diámetro de la base rama ampliada en combinación con una curvatura suave en la zona de transición entre el vástago y la rama ayuda a reducir la magnitud de la tensión y conducir a una distribución de tensiones homogéneo sin picos de tensión muesca críticos en el lado abaxial y adaxial de la base de rama.

v  Conclusiones

o    Pilosocereus pachycladus: El modelo que representa la estructura de soporte vascular lignificadas de la ramificación de P. pachycladus y muestra que las muescas en el lado adaxial y abaxial en combinación con el comportamiento del material ortotrópico dividen el estrés máximo en dos partes principales y cambian ellos lateralmente hacia la periferia de la rama (comparar figura 4e, i con la figura 4c, g). No hay concentraciones críticas de estrés se pueden encontrar en las regiones mediana.

En las simulaciones que también  tengan la corteza suculenta en cuenta a una reducción de la tensión de compresión en el tejido vascular en el lado abaxial de la base de rama, podría ser detectado como si  la corteza suculenta disipase en parte el esfuerzo de compresión (Ver flecha en la figura 4 k).

o   Cleistocactus morawetzianus: La ramificación es morfológicamente muy similar a P. pachycladus, lo que sugiere que los resultados son transferibles a C. morawetzianus. Por lo tanto, no se realizó la simulación adicional.

o   Myrtillocactus geometrizans: La simulación excluyendo la corteza cuenta con una distribución de la tensión homogénea sin concentraciones de tensiones en el lado abaxial de la ramificación similar al modelo Mattheck (comparar figura 4j con la figura 4h). En el lado adaxial, el comportamiento del material ortotrópico de la madera de cactus conduce a un desplazamiento lateral de la tensión máxima. La sección media está libre de tensiones de tracción. La diferencia con una ramificación del árbol "normal" se fundamenta en las simulaciones, incluyendo la corteza. La tensión de estreses máximos y mínimos de la tensión de compresión en el tejido vascular se reducen en casi un 50%. La corteza se disipa en parte el esfuerzo de compresión en el lado abaxial de la rama (flechas en la figura 4l).

v  Bibliografía

Schwager H, Masselter T, Speck T, Neinhuis C. 2013 Functional morphology and biomechanics of branch–stem junctions in columnar cacti. Proc R Soc B 280: 20132244. http://dx.doi.org/10.1098/rspb.2013.2244

Klein B. 2005 Leichtbau-Konstruktion, 6th edn. Wiesbaden, Germany: Vieweg. 

Mauseth JD, Kiesling R, Ostolaza C. 2002 A cactus odyssey. Portland, OR: Timberpress.

Mauseth JD. 2006 Structure –function relationships in highly modified shoots of Cactaceae. Ann. Bot. 98, 901– 926. (doi:10.1093/aob/mcl133)

Niklas KJ, Molina-Freaner F, Tinoco-Ojanguren C. 1999 Biomechanics of the columnar cactus Pachycereus pringlei. Am. J. Bot. 86, 767– 775. (doi:10.2307/2656697)

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