Panda gigante Ailuropoda melanoleuca, historia Natural y Conservación.

Abstracto: El panda gigante Ailuropoda melanoleuca, es  una especie endémica de las montañas de Sichuan, Gansu y Shaanxi en China. Las especies habían numerado más de 2.000 animales en principios de 1970, pero declinaron a no más de 1.000 animales fragmentados en quizás 32 subpoblaciones en finales de 1990 como resultado de numerosas fuerzas negativas, tales como: la reducción de su hábitat, la caza furtiva y la floración de bambú. Por lo que ahora se la considera en peligro de extinción. La situación de supervivencia se ve agravada por el hecho de que el hábitat de panda está fragmentado en muchas pequeñas "islas", cada uno que contiene sólo unos pocos pandas. Tales poblaciones panda pequeñas y aisladas se vuelven aún más vulnerables a las amenazas de forma extinción tales como la degradación del hábitat, los desastres naturales, las enfermedades y los efectos deletéreos de la endogamia. Así que la restauración del hábitat del panda y la reintroducción de pandas a su hábitat histórico, puede resultar un complicado tema para la protección del panda gigante en el medio silvestre.

 a)     DESCRIPCIÓN GENERAL:

El panda gigante tiene un pelaje blanco y negro. Los adultos miden alrededor de 1.2 a 1.8 m (4 a 6 pies) de largo, incluyendo una cola de unos 13 cm (5,1 pulgadas), y de 60 a 90 cm (2,0 a 3,0 pies) de alto en el hombro. (Caro 2005). Los machos pueden llegar a pesar hasta 160 kg (350 libras) y las hembras (generalmente 10-20% más pequeño que los machos). Según Brown (1996): pueden pesar tan poco como 75 kg (165 lb), pero también puede llegar a pesar hasta 125 kg (276 libras). Medida de peso adulto es de 100 a 115 kg (220 a 254 lb).

El denominado “panda gigante” Ailuropoda melanoleuca, es una de las más importantes especies a la que se le otorgan gran parte de esfuerzos relacionados con la conservación del hábitat, es una de las especies raras y en peligro de extinción más importantes en el mundo, y pertenece a la primera categoría de especies protegidas en la Lista Roja de China (Wei et al. 2000) Una gran cantidad de investigaciones indica que los pandas gigantes suelen utilizar los bosques primarios (RAN y otros, 2003, 2004;. Wang et al., 2006), aunque algunas investigaciones sugieren que también utilizan los bosques secundarios (Zhang et al. 2002).

Ailuropoda melanoleuca es una de las especies en peligro de extinción más crítica del mundo, con un total de 1.600 individuos reportados en la última encuesta. Históricamente, esta especie se distribuye ampliamente en el suroeste de China, pero ahora se limita a seis cadenas montañosas aisladas a lo largo del borde oriental de la meseta tibetana. La gama se ha fragmentado en más de 30 hábitats aislados y la población se divide en un estimado de 24 grupos, la mayoría con menos de 50 individuos por tanto estas poblaciones pequeñas y aisladas se enfrentan a un gran riesgo de depresión endogámica. (O'Brien et al 1994;. Loucks et al., 2001).

A pesar de los esfuerzos del gobierno, las organizaciones internacionales, y la población local, la pérdida y fragmentación del hábitat del panda ha puesto en peligro la especie en toda su área de distribución (Administración Forestal del Estado de 2006; Shen et al. 2008). Por lo tanto, una mejor e intensa realización de requerimientos de hábitat del panda gigante se necesita para desarrollar estrategias específicas de conservación para esta especie en peligro de extinción. (Kang et al.  2013).

Según los autores (Pan et al 1998;. Hu 2001; Ouyang et al 2001;. Wang et al 2002;. Liu et al 2005, 2006;. Yang et al. 2006; Xu et al. 2006;. Swaisgood et al 2010;. Wang et al. 2010;.. Wei et al. 2011), El conocimiento adquirido sobre los requerimientos de hábitat de especies animales proporciona información importante y necesaria para la planificación de la conservación y la elaboración de políticas.

Fig 1. Vista frontal de un oso Panda Ailuropoda melanoleuca. Tomada por J. Patrick Fischer en Ocean Park, Hongkong, 2009. Imagen Libre de derechos de autor.

B) EVOLUCIÓN, FILOGENIA Y BIOGEOGRAFÍA

Carnívora (leones, tigres y osos, entre otros) representan un orden de tamaño medio dentro de los Mamíferos. Éste orden es notorio por el atractivo carismático de muchos de sus miembros, así como la gran diversidad que albergan en sí. Con la inclusión de ambas especies terrestres y acuáticas, Carnívoros es una de las pocas órdenes de mamíferos que los tenemos naturalmente en todos los continentes (Nyakatura & Emonds, 2012).

Fig 2. Los tiempos relativos de divergencia estimados para los principales linajes de carnívoros. (K Nyakatura, ORP Bininda-Emonds, 2012) BMC Biology - biomedcentral.com

Durante mucho tiempo,el panda gigante, junto al panda rojo, fue incluido en la familia de los prociónidos, la misma de los mapaches. Pruebas genéticas recientes lo colocan en la familia de los osos Ursidae, siendo su pariente más cercano el oso de anteojos de América del Sur (O'Brien et. al 1985)

Tal como en el árbol de la vida que se representa a continuación, Ailuropoda melanoleuca forma parte del grupo hermano de las especies restantes de Ursidae, (17,2 Ma; IC del 95%, 15,6-18,9 Ma frente a 21.8 Ma). Tremarctos ornatus está firmemente colocado como el grupo hermano de un Ursinae monofilético. Las relaciones dentro de estos últimos siguen siendo problemáticas y nuestra topología inferido, que no apoya la monofilia de Ursus, refleja sólo otro en una larga línea de hipótesis contradictorias (comparar [47,64,68,69]). Las dificultades aquí, sin duda, se derivan de una radiación adaptativa inferido para el grupo un 5 Ma hace [68], un resultado y valor cercano al recuperado aquí (hace 6,3 Ma; IC del 95%, 5,7-7,0 Ma hace). Porque incluso la aplicación de cantidades cada vez mayores de datos de secuencias moleculares no parecen estar dando una topología de consenso para Ursinae, un enfoque alternativo que incluya datos meta-genómica (por ejemplo, los cambios genómicos raras como Sines o reordenamientos cromosómicos) podrían ser necesarias para  traer solución a este problema. El súper árbol (Figura 3) contiene todas las 286 especies de carnívoros enumerados en Wozencraft [14]. Datos de la secuencia de ADN de GenBank sólo estaban disponibles para 229 de estas especies (Nyakatura & Emonds, 2012).

Fig 3. Un recorte del super árbol de los carnívoros, demostrando las mejores estimaciones de los tiempos de divergencia. Ursidae (verde oscuro) Los intervalos de tiempo están en unidades de 5 Ma

Sin embargo, estos análisis globales ocultan una diversidad en patrones macro evolutivos para todo el linaje carnívoro (Figura 12). Mientras que la familia Ursidae presenta una tasa de especiación neta constante en toda su historia, los restantes linajes, generalmente más grandes, muestran al menos un punto de inflexión en sus parcelas (linajes) a través de los tiempos.

La evidencia fósil ha demostrado que a finales del Pleistoceno, hace 0.700.000 años, el panda gigante se distribuyó ampliamente en Myanmar (Birmania), el norte de Vietnam, y gran parte del este y el sur de China hasta el norte de Beijing. Su área de distribución se ha contraído a través del cambio climático, y en los últimos siglos, el aumento de los asentamientos humanos. La especie se limita ahora a seis cadenas montañosas aisladas en las provincias de Sichuan, Gansu y Shaanxi a lo largo del borde oriental de la meseta tibetana. El área restante de hábitat de panda adecuado asciende a unos 29 500 km2 (Hu 1985).

El panda gigante una vez tuvo una amplia distribución en el suroeste de China, incluyendo Hunan, Hubei, Sichuan, Shaanxi y Gansu en los siglos XVI y XIX. Sin embargo, la destrucción del hábitat y fragmentación han extirpado desde la mayor parte de su área de distribución original y la población de panda gigante se ha reducido drásticamente. En la década de 1980 se estimó que la población mundial de osos panda gigante en alrededor de 1000. (WWF MOF 1989) Ahora pandas gigantes están restringidos a la Qinling aislado, Min-shan, Qionglai, Daxinganling, Xiao Xiang Ling y montañas Liang-shan (Zhu et. al, 2007)

Fig 4. Distribución actual e histórico del panda gigante. Las zonas negras muestran su actual distribución; Los círculos blancos: registros fósiles en el Pleistoceno temprano y los círculos negros: los registros fósiles de mediados y finales del Pleistoceno. (L Zhu, XD Ruan, YF Ge, QH Wan, SG 2007) BMC Genetics - biomedcentral.com

Dado que la estimación de la población necesita mejores censos, los científicos chinos han aplicado el método huella dactilar de ADN para identificar el tamaño de la población en el medio silvestre (Él 1998; Wei 1999; Yang 1999). Por ejemplo, Ou Weifu y sus colegas utilizaron técnicas de ADN para investigar la población silvestre en la Reserva Natural de Tangjiahe (Ou 1999). Su resultado muestra que hay 37 pandas gigantes pertenecientes a 6 familias que sobreviven en la reserva. También demuestra que la población silvestre perteneciente a esta reserva tan bien administrada ha reducido 44 a 37 animales en los últimos cinco años.

 Fig 5.Población del Panda en la selva. (Zhao-hua & Denich 2001)

Los fósiles de la panda gigante Ailuropoda (Orden Carnívora, Familia Ursidae) son en gran parte los dientes aislados, mandíbulas, y algunos cráneos raros, conocido desde finales del Plioceno al Pleistoceno tardío en China y el sudeste asiático. Gran parte de este material representa un cronoespecie Pleistoceno, Ailuropoda baconi, un animal más grande que el panda gigante vive, Ailuropoda melanoleuca. El primer registro de cierta Ailuropoda es a finales del Plioceno, cronoespecie Ailuropoda microta, más pequeño que sea A. baconi o A. melanoleuca, y anteriormente conocido sólo en los dientes y las mandíbulas de un par de cuevas kársticas en el sur de China. El descubrimiento del primer cráneo de A. microta, establece su anatomía craneal y la demostración de que las adaptaciones craneales y dentales especializadas del Ailuropoda de la conducta alimentaria durophagous centrado en bambú eran ya evidentes en esta especie Plioceno tardío. El cráneo de Jinyin cueva (Guangxi) y restos dentales de otras localidades karst en el sureste de China muestran que Ailuropoda microta ocupó el sur de China desde ≈2 a 2,4 Myr hace después de un deterioro climático global marcado. La anatomía Dental craneoespinal indican una morfología temprana menos especializada en la historia del linaje y el apoyo derivación de la panda gigante del Mioceno asiática úrsido Ailurarctos (Jin et. al, 2007)

C) TAXONOMÍA

El Panda Gigante fue visto por primera vez por David Père Armand en 1869 (Carter 1999). El primer intento de clasificación por Armand, puso al panda bajo el género Ursus, llamándolo Ursus melanoleucus en 1869. En 1870, Alphonse Milne-Edwards rebautizó al animal con el nombre actual (Altonaga, 1998) Llega a medir en promedio 120-180 cm de longitud con una altura a la cruz de 65-75 cm, el peso registrado en vida libre va de 60-73 kg, mientras que en cautiverio el peso promedio va de 80-125 kg, siendo el panda más pesado registrado de 181.5kg (Zhang Hemin, 2007)

Los miembros de la familia de los osos tienen cinco dedos en cada pie y algunos pueden caminar erguidos para distancias cortas. Los osos son animales inteligentes, con un gran sentido del olfato. Ailuropoda es un género de mamíferos placentarios de la familia de los úrsidos que contiene cinco especies de pandas, de las que solo una, Ailuropoda melanoleuca (panda gigante), existe hoy en día; las otras cuatro especies son cronoespecies prehistóricas. A pesar de su taxonomía que los clasifica dentro del orden Carnivora (carnívoros), el panda tiene una dieta principalmente herbívora, que consiste casi exclusivamente en bambú. (Jin et. al, 2007)

Existen dos subespecies de panda:

·         Ailuropoda melanoleuca melanoleuca - a la que pertenece la mayor parte de la población de pandas; se encuentra en las regiones montañosas de Sichuan.

·         Ailuropoda melanoleuca qinlingensis - vive en las montañas Qinling en Shaanxi a 1,300–3,000 msnm. Se distinguen de la variedad de Sichuan por tener una coloración distinta (marrón claro y oscuro) y una cabeza más pequeña con molares más largos.

D) GENÉTICA POBLACIONAL:

Aunque el programa de cría en cautividad de esta especie lleva ahora casi dos décadas de antigüedad, investigadores sobre los antecedentes genéticos de este tipo de poblaciones cautivas, en especial en el polimorfismo molecular de adaptación de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), todavía son limitados. (Zhu et al. 2007) Por otro lado, los marcadores de microsatélites se aplican ampliamente en los estudios de variación genética en las especies en peligro de extinción debido a los altos niveles de variaciones, pequeña cantidad de ADN necesaria y las técnicas de muestreo no invasivo (Jarne y Lagoda 1996; Beaumont y Bruford 1999). Las técnicas no invasivas de identificación de sexo de fauna libre van proporcionando nuevas oportunidades para mejorar método de censo, determinar la composición por sexo (sex ratio) de los grupos sociales, e incorporar los datos de sexo en-análisis macro en curso de las muestras de heces o pelo (Bradley et al. 2001).

En la actualidad, las pruebas más comunes que determinan sexos en mamíferos incluyen: (1) Amplificación del gen-específico Y,  tal como SRY (Woods et. Al, 1999), y (2) PCR/ RFLP sistema que se concentra en  genes X y genes Y homólogos tales como la amelogenina (AMELX y AMELY) genes o dedos de zinc (ZFX y ZFY) genes de proteínas (Ortega et al. 2004).

Pero, el sistema SRY, aunque produzca resultados de amplificaciones macho-específicos, la amplificación nula podría originarse tanto por resultados que realmente supongan que se trata de una hembra como también de fallos de PCR,  haciendo resultado equívoco que tanto la no-amplificación del marcador Y verdaderamente represente un origen femenino. Aunque la co-amplificación de un fragmento del gen mitocondrial o nuclear como un control externo pueda abordar este problema (Palsbøll et al 1992;.. Kamimura et al 1997)

Se ha desarrollado un método barato, rápido y fiable de PCR para la identificación de sexo del panda gigante Ailuropoda melanoleuca mediante el uso de un par de cebadores para co-amplificar fragmentos homólogos con el polimorfismo de tamaño que encuentra en amelogenina (AMEL) exón 5. En panda gigante, una deleción de 63 pb en el exón 5 del alelo ligado Y, ofrece una ni significativa distinción entre AMELX y AMELY, por tanto, los productos de amplificación se pueden distinguir simplemente por electroforesis en gel de agarosa, exhibiendo patrones de bandeo  sexo-específios (masculino: 237 pb, 174 pb ; mujeres: 237 pb). Tanto muestras de sangre y de heces de pandas gigantes que ya se conocían su sexo, fueron exitosamente identificados. También una prueba de especies similares, reveló que este método podría ser aplicado a otras especies Ursidae (Xu et al. 2008)

Fig 6. En gel de agarosa demostrando resultados de identificación del sexo Ursidae con SP3/SP4. Géneros, especies y recursos de las muestras son exhibidas en la parte inferior. (Xu et. Al 2008)

Aunque por el otro lado, debido a la infertilidad masculina y la ausencia de los machos en las poblaciones, los administradores de zoológicos por lo general emplean el esperma de varios machos para llevar a cabo la inseminación artificial (IA) con el fin de asegurar la reproducción de los pandas gigantes en cautiverio (Wan et al. 2006).

A pesar del uso de la IA contribuye en relativamente gran parte de las poblaciones cautivas, también creó un problema de introducir varios machos y una sola hembra al libro de registros genealógicos, haciendo de este modo la genética como la única manera de conseguir un pedigrí para aquellos nuevos animales. Es una lástima que los marcadores genéticos para el panda gigante se desarrollaron muy recientemente (Fang et al, 2002a;. Zhang et al., 2003).

Como consecuencia a esto, la paternidad por descendientes anteriores causados por IA no se puede determinar. La información de pedigrí correcta, es vital para los planes de reproducción, por lo que se requieren identificar los verdaderos padres de los casos de indeterminados por IA. (Morin y Ryder de 1991; Frankham et al. 2002).

De todos modos, la mayor parte de los pandas involucrados en los viejos casos de IA murieron y su única fuente de material son tejidos fijados en formalina. Por lo tanto, la extracción de ADN de estas muestras es esencial (Wan et. al 2006).

Panda gigante es una especie rara y muy compleja, su estimación poblacional es basada en las evidencias que poseen las heces. Si las muestras fecales estudiadas de una población a gran escala son recogidas, pueden ser conservadas durante mucho tiempo. Los análisis genéticos basados en ADN fecal harán mucho más pronta la conservación y gestión de los pandas gigantes salvajes. La post-colección es un problema crítico con muestras no invasivas (Hu 2001; Panet et al. 2001)

Estudios anteriores llevado a cabo por otros autores, se han hecho para evaluar el éxito de diferentes métodos de conservación, incluyendo almacenamiento de muestras en el congelador, en alcohol, secado con gel de sílice, secado al horno (Murphy et al. 2002; Roeder et al. 2004) y por último, pero sobre todo muy importante, la fijación formalina, que no es una técnica invasiva ya que sólo añade deshidratación de etanol a los procedimientos de extracción de ADN en comparación con otros métodos de conservación tales como el alcohol, secado, etc. Y además, el método podría preservar muestras para mucho tiempo, lo que sugiere tres aplicaciones posibles: (1) la preservación de las heces recogidas en la encuesta a gran escala para asegurar el post-análisis genético a gran escala; (2) la preservación de muestras de animales en peligro de extinción y raras para futuros estudios; (3) permite el acceso de las muestras de tejido a museos. Estos métodos han recuperado y siguen recuperando altamente ADN degradado a partir de muestras fecales que tenían varios meses (Wan et al. 2006).

E) REPRODUCCIÓN:

Los pandas gigantes son un reto para reproducirlos en cautiverio debido a sus características reproductivas muy particulares. Su reproducción es vivípara, las hembras alcanzan la madurez reproductiva hasta los 5-6 años de edad, son consideradas monoestricas estacionales, por lo tanto el apareamiento tiene lugar en primavera. Con un periodo fértil de solo 24 a 72 horas, la gestación puede durar de 85 a 185 días, regularmente tienen una cría y rara vez dos con un intervalo entre partos de 18 meses. (Soto, 2010)

Así mismo los machos alcanzan la madurez reproductiva un poco más tarde, a los 6- 7 años de edad. En las hembras de esta especie la amplitud observada en la gestación es debido al fenómeno llamado implantación retardada, que es el intervalo de tiempo entre la formación del conceptus hasta su implantación en el útero y el comienzo del desarrollo fetal que en esta especie es variable. (Soto, 2010)

Los factores endócrinos y parácrinos que dirigen esta característica aún se desconocen. Además las pandas gigantes manifiestan pseudogestación, con la cual exhibe conductas y cambios fisiológicos y hormonales similares a una gestación verdadera. Durante la estación sexual la hembra y el macho sincronizan las conductas proceptivas y receptivas a través de comunicación química y vocal (“borregueo”). Las conductas proceptivas incluyen el acercamiento o proximidad y el contacto, posteriormente las conductas receptivas como la presencia de lordosis y el levantamiento de la cola preceden a los intentos de monta por el macho. (Soto 2010)

F) DISTRIBUCIÓN:

Antes de la agricultura extensiva y la deforestación en China, el panda gigante solía vivir en muchas áreas de las tierras bajas del interior de China. Tras el crecimiento de las prácticas de tala y la agricultura, la especie se distribuyó solamente en tres provincias de la República Popular de China: Sichuan, Shaanxi y Gansu y su hábitat se encuentran fragmentado en un promedio de 24 islas continentales (regiones montañosas). Considerando el panda gigante como una de las especie de oso más vulnerable. (Juárez, et al. 2011).

Existen dos subespecies de panda:

·         Ailuropoda melanoleuca melanoleuca - a la que pertenece la mayor parte de la población de pandas; se encuentra en las regiones montañosas de Sichuan.

·         Ailuropoda melanoleuca qinlingensis - vive en las montañas Qinling en Shaanxi a 1,300–3,000 msnm. Se distinguen de la variedad de Sichuan por tener una coloración distinta (marrón claro y oscuro) y una cabeza más pequeña con molares más largos (Servín, s.f.)

G) USO DEL HÁBITAT:

El oso panda gigante habita en los bosques fríos y húmedos de alta montaña con sotobosque de bambú del centro de China, a altitudes que oscilan entre los 1.500 y los 3.000 m. de altitud. La especie ha tenido que adaptarse al ambiente, por lo tanto presenta ciertas características que le permiten la supervivencia, tales como: El “sexto dedo” del oso panda, se origina en el hueso de la muñeca, que le da al panda gigante la fuerza adicional necesaria para arrancar los brotes y las hojas de los tallos de bambú. Este dedo extra es crucial para su supervivencia ya que un 99 por ciento de su dieta se compone de los brotes y hojas de bambú.

Debido a que la planta de bambú es resistente y elástica, el oso panda tuvo que desarrollar músculos fuertes en sus mandíbulas, además desarrollaron una cavidad craneal ampliada que cómodamente puede albergar los fuertes músculos mandibulares necesarios para masticar el bambú. Por lo tanto, estas adaptaciones le permiten masticar cómodamente durante largos períodos de tiempo. Junto con los fuertes músculos de la mandíbula, el panda gigante tiene los dientes adecuados para poder masticar el bambú, desarrollando molares más suaves y más grandes que los molares de un oso normal.

Finalmente, el sistema digestivo del panda gigante tiene que ser lo suficientemente fuerte como para manejar el consumo de bambú. El revestimiento de su esófago se ve reforzado para que las fibras de bambú no puedan atravesarlo en su camino hacia el estómago, además su estómago tiene un revestimiento más duro, así como músculos más fuertes, para ayudar con la digestión del bambú duro. (Kaczmarek, 2015).

ESTADO DE CONSERVACIÓN:

El oso panda está en peligro crítico de extinción puesto que la especie está en un 80% localizada, alrededor de 1.600 viven el selvas, y 188 en cautiverio. A lo largo de los años, la población se ha ido trasladando a las zonas habitadas por el oso panda con la intención de la tala masiva de bosques de bambú, por lo tanto gran cantidad de animales de esta especie han muerto debido a la falta de alimentación. (Correa, p. 3).

Datos oficiales de la WWF:

El Fondo Mundial Para la Naturaleza (WWF) toma la imagen de un oso panda para emitirla como símbolo de la marca y concientizar sobre la conservación de la especie. 

Debido a que la conservación del oso panda requiere mucho trabajo, el Gobierno de China ha aislado 11 reservas naturales en las que abunda el bambú y se conoce que viven pandas. En diferentes asociaciones en donde se tienen a los osos pandas en cautiverio, se ha considerado ubicar a un macho y a la hembra para poder llegar a la reproducción.

La especie del oso panda está incluida en la categoría 1 (máximo nivel de protección), de la Chinese Wildlife Conservation desde 1988. Además en 1989 el Ministerio Chino de Silvicultura y WWF redactaron un plan nacional de conservación para el panda gigante.

Además se fomenta aumentar la cantidad y calidad de hábitats adecuados para la especie. A partir de 1963, las reservas forestales se crearon específicamente para la conservación del oso panda. En 1990, se han establecido 13 reservas y actualmente hay cerca de 60.

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Mantenimiento y crioconservación de la línea celular tumoral A549

El cultivo de tejidos se ha sido considerado inicialmente como una técnica difícil de aprender. Aunque en el presente, estas dificultades se han superado gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas, etc. 

A continuación, presentaré una forma fácil para aprender a mantener y crioconservar la línea celular tumoral humana A549 proveniente de pulmón, empleando técnicas de cultivos celulares, y colaborar con el correcto funcionamiento del laboratorio.

·         Introducción:

Al establecer un cultivo celular se seleccionan las células que van a crecer en función de numerosos criterios: sólo formarán parte del cultivo aquellas células que sean capaces de superar el proceso de disgregación, de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en monocapa, bien en suspensión). Crecer en monocapa significa que las células se adhieren al sustrato y en esta forma inician la proliferación. Cuando se mantiene un cultivo se establece una nueva selección: aumentan el número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. Al alcanzar la confluencia en el cultivo, se pueden observar muchas líneas celulares expresando sus aspectos más característicos en cuanto su morfología y fisiología son más parecidas a su estado original..

Las aplicaciones de los cultivos celulares pueden ser tanto en la investigación básica como en la aplicada. En la investigación básica, permiten estudiar fenómenos complejos, entre las aplicaciones más importantes: la actividad intracelular (transcripción de ADN, metabolismo energético), el flujo intracelular de biomoléculas (procesamiento del ARN), Genómica, Virología, Biotecnología y ecología celular.

Así mismo el manejo in vito de células presenta   ventajas las más importantes son: que permiten un control preciso y fino del medio ambiente, una caracterización y homogeneidad de la muestra celular y el bajo costo económico. 

Por otra parte, las desventajas del mantenimiento de una línea celular se dan por que es una técnica sensible, también la cantidad y la inestabilidad genómica que muchas células tienen, conlleva que afecte su velocidad de crecimiento como su capacidad de diferenciarse.

En nuestro proyecto hemos trabajado con la línea celular tumoral humana A549  las cuales son células alveolares de cáncer basales epiteliales de humanos. Esta línea celular fue desarrollada por primera vez en 1972 por DJ Giard, et al. A través de la extracción y cultivo de tejido pulmonar canceroso de un hombre caucásico de 58 años.

En la naturaleza, estas células son escamosas y responsables de la difusión de algunas sustancias, tales como agua y electrolitos, a través de los alvéolos de los pulmones. Si estas se cultivan in vitro, crecen como células en monocapa adherente.

Dentro del mantenimiento de una línea celular es indispensable su crioconservación con el objetivo de crear bancos de células las cuales se utilizaran dependiendo de interés científico, es así que como parte de mis objetivos fue aprender la técnica de crioconservación de la línea celular A- 549.

La palabra griega "cryo" significa frío. La criobiología es la ciencia que estudia la preservación de los materiales biológicos enfriándolos a temperaturas criogénicas. Su objetivo principal, es la conservación de células vivas mediante la utilización de las bajas temperaturas, frenando los procesos,  envejecimiento y degeneración celular, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula. Generalmente las células son congeladas entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. (Loyzaga 2011)

En farmacología y Toxicología se emplean ampliamente los modelos basados en la reactividad de las células aisladas. (Loyzaga 2011)

Y aunque si bien las células después de haber sido descongeladas en el laboratorio, deben sobrevivir a un ambiente artificial en la caja, este debe ser estéril y sobre todo debe proporcionar a las células un ambiente adecuado con los siguientes factores: el primero que es la temperatura, como si fuese el mismo cuerpo humano donde estas se encuentran, el factor de espacio: la caja no debe contener demasiadas células y finalmenteel factor principal: poseer los nutrientes necesarios en el medio suplementado, para que solo de esta forma las células puedan crecer normalmente y evadir el comúnmente denominado“estrés celular” y sobre todo puedan sobrevivir.

·         Materiales y Metodología:

Cámara  de Flujo Laminar: Usadas para preparar productos estériles que no casan daño alguno al operador y productos (Delgado & Díaz 2005)

Tripsina: Sirve para desasociar células por métodos químicos, La reacción de la tripsinización se debe parar luego de dos o tres minutos con la adición  inhibidor de tripsina inmediatamente. (Fernández 1997) para evitar el estrés célular.

PBS: Es uno de los buffers más utilizados porque es isotónico y no tóxico para las células. Se utiliza para diluir sustancias utilizadas para el cultivo y para lavar los recipientes que contienen células.

Cámara de Neubauer (Hematocitómetro Muchos experimentos biomédicos requieren la manipulación de una cantidad conocida de células, con el fin de lograr datos precisos, reproducibles, y estadísticamente relevante. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica particularmente esencial para cualquier científico biomédico. La forma más común para contar las células es mediante el uso de un hemocitómetro - un instrumento que lleva dos rejillas grabadas con láser, que ayudan en la enumeración de las células de una alícuota bajo un microscopio.

Frasco de cultivo de Roux: Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión.

El azul de tripano: se usa comúnmente como colorante en microscopía (para el recuento de células).

El medio por el cual las células se encuentran dentro y  por ende crecen y dividen se conoce como “medio suplementado”. Su composición de solución química no comprende en su totalidad un medio basal, sino que este suele ser suplementado con otras sustancias clave, entre ellas:

Aminoácidos esenciales, un suplemento común de aminoácido es la conocidaL glutamina,  aunque inestable en el medio se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado. La usamos en una concentración del 1%.

Hormonas y factores de crecimiento: suero fetal bobino ("fetal bovine serum FBS) que es usado en líneas más exigentes. Este suero tiene la propiedad química de inhibir la tripsina. La usamos en una concentración del 10%.

Se añaden inhibidores del crecimiento de los contaminantes: antibiótico- antimicótico. (En el laboratorio de la UTPL, se suele suministrarlocuando preparan el medio basal). Su concentración es del 1% para ser usado.

Condiciones de cultivo.

Las línea celular fue cultivada en medio base RPMI-1640 (GIBCO) suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% (GIBCO), antibiótico-antimicótico (100 Unidades/ml de Penicilina G, 100 µg/ml de sulfato de Estreptomicina y 0,25 µg/ml de Amphotericina B como Funfizona) (GIBCO), 2 mM de L-glutamina (GIBCO), Bicarbonato de sodio al 0,2% (MERCK). Los cultivos celulares se mantuvieron en incubación a 37°C de Temperatura en una atmósfera humidificada al 5% de CO2.

Un parámetro adicional que nos permite conocer el crecimiento de nuestra línea celular es observar  el viraje del color del medio, ya que se sabe que cuando las células no crecen, el medio no se consume y permanece en su color original rosa intenso, por otra parte se ha comprobado que cuando las células están creciendo normalmente el medio tiende a acidificarse tomando un color durazno o amarillo.

Descongelar las células:

Antes de iniciar cualquier operación el laboratorio,  se acondiciona el área de trabajo. Esto significa que la cabina de flujo laminar previamente debe haber estado con UV durante 15 minutos y otros 15 minutos con flujo de aire.

En una caja de 25 cm²,colocamos 3ml de medio suplementado. Retiramos los criotubos del depósito de nitrógeno líquido serán transportados de forma inmediata a un baño térmico a 37ºC, procurando que la parte superior no quede sumergida enel mismo.

Cuando su contenido se encuentre en un estado líquido en más o menos de 3-4 minutos, volteamos el contenido del criotubo dentro del frasco de cultivo 25 cm², y procedemos a homogenizar con movimientos ascendentes con el fin que las células se distribuyan por toda la superficie.

Una vez que las células estén en el frasco de cultivo, se comprobará el resultado de la siembra mediante observación en un microscopio invertido.

 Transcurridas dos horas, se procederá a realizar el cambio de medio de cultivo

Cálculos previos para el mantenimiento celular:     

Previó a cualquier ensayo a realizarse con cultivos celulares se debe llevar una planificación  para saber el número aproximado de células que vamos a necesitar para lo cual se revisa la información de la línea celular y constatamos el periodo de réplica lo cual va sujeto al área de cultivo, es así como  obtendremos una relación entre el número de células que necesitamos y el área del frasco de cultivo.

Para llegar a proceder con nuestros cálculos, necesitamos saber cuántas células entran dentro de nuestros materiales de trabajo, uno de estos es llamado “crio vial” (tubo en que se congelan las células) en donde entran aproximadamente 1’200.000 células.  En un frasco Roux (botella donde crecen las células es suspensión) entran 7’500.000 células como máximo. La tasa de crecimiento celular es logarítmica y se da cada 24 horas, es así que planificamos el número inicial de nuestro cultivo.

Mantenimiento celular:     

1.        Una vez que todos nuestros materiales mencionados y nuestro lugar de trabajo se encuentra estériles, introducimos estos frascos limpiándolos con alcohol para no dejar introducir agentes externos a la cámara de flujo laminar.

2.        Tomamos la caja de cultivo que ya tiene las células descongeladas y la introducimos limpiándola con alcohol exteriormente.

3.        Eliminamos de la caja el medio consumido y ponemos 5ml de PBS así “lavamos la caja”.

4.        Eliminamos el PBS con la bomba  de vacío succionándolo para dejar la caja vacía y agregamos 500 µl de tripsina, dejando que actúe  durante 2 minutos.

5.        Para inhibir la tripsina usamos medio suplementado (siempre la cantidad de medio suplementado debe doblar a la cantidad que se usó en tripsina para que esta enzima deje de actuar)

6.        Pasamos la suspensión celular  a un tubo Corning para centrífuga durante cinco minutos a 1500 rpm.

7.        Durante este periodo de centrifuga preparo el material que voy a utilizar como es el hemocitometro con el cual realizaremos el recuento celular, este debe estar en buenas condiciones y se lo debe limpiar siempre antes de cada uso.

8.        Luego retiramos nuestro tubo para eliminar el sobre nadante y mantener el pellet, debemos aspirar con cuidado el sobrenadante teniendo cuidado de no perder  el pellet, seguido resuspendemos el pellet con 1ml de medio suplementado y homogenizamos.

9.     La cuantificación del número de células por mililitro se realizó mediante el método de exclusión con azul de tripano, contando en la cámara de Neubaüer  5 campos. Se calculó el número de células mediante la aplicación de la siguiente fórmula:

La finalidad de esto es responder a la pregunta ¿Cuánto es el número de células viables por ml?

10.  Cuando inserte en el microscopio este Hemocitómetro, usar un acercamiento [40X Filtro 1 (ph1)]. Nótese que son 2 espacios de almacenamiento distintos los que tiene la cámara de Neubauer, cada uno comprende de nueve cuadrantes y solo se cuentan las células en los cinco espacios marcados en el presente gráfico:

11. Una vez contados las células de los cinco espacios de los dos compartimientos del Hemocitómetro, se saca una media de estas.

¿Cuántas células hay en el Hemocitómetro?

Mi media fue 156.5, mi factor de dilución 50 y dividido para los cinco cuadrantes obtuve 1565 que al multiplicarlo por 10.000 (volumen del diámetro de la cámara de Neubauer) me dio igual a 15’650.000 células en el Hemocitómetro.

Ecuación final para saber cuántos µl necesito sacar:

Para saber ¿cuántos ml debo sacar del tubo Corning hacia mi caja? se aplica la siguiente fórmula:

·         Resultados Y Discusión:

Aprender que las células crecen logarítmicamente. Observando su morfología correcta y verificando la confluencia de crecimiento, reconocer si mi cultivo se encuentra en buenas condiciones, mantenerlo libre de hongos y levaduras, así mismo pude diferencia la apariencia celular cuando estas se encontraban en buen estado y cuando estas se encuentran en condiciones de estrés como por ejemplo por falta de nutrientes. Así mismo puedo reconocer  si es necesario o no subcultivar, así como habrá días en los que solamente se requiera cambiar el medio cultivo. En casos que no se cambie el medio las células a tiempo o pertinentemente  pueden estresarse y por consecuencia la tasa de crecimiento no será normal.

Finalmente pude colaborar con un incremento de 5 nuevos crioviales que contienen células A 549 para el banco de células del laboratorio, así como he aprendido la importancia de un adecuado uso de los materiales, reactivos y equipos que se emplean para estas técnicas in vitro

Conclusiones

Todas las líneas celulares son propensas a estresarse o contaminarse para lo cual debemos evitar el mal uso de los reactivos y equipos, se debe llevar un control diario de la morfología de las células, antes de iniciar el trabajo se debe constatar que se cuente con el material necesario así como estar seguro de entender las técnicas y los cálculos necesarios para un buen trabajo.

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