El cultivo de tejidos se ha sido considerado inicialmente
como una técnica difícil de aprender. Aunque en el presente, estas dificultades
se han superado gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los
medios de composición definida, las instalaciones asépticas, etc.
A continuación, presentaré una forma fácil para aprender a mantener y
crioconservar la línea celular tumoral humana A549 proveniente de pulmón,
empleando técnicas de cultivos celulares, y colaborar con el correcto
funcionamiento del laboratorio.
·
Introducción:
Al establecer un cultivo celular se
seleccionan las células que van a crecer en función de numerosos criterios:
sólo formarán parte del cultivo aquellas células que sean capaces de superar el
proceso de disgregación, de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en
monocapa, bien en suspensión). Crecer en monocapa significa que las células se
adhieren al sustrato y en esta forma inician la proliferación. Cuando se mantiene
un cultivo se establece una nueva selección: aumentan el número aquellas
células que tienen una mayor tasa de crecimiento. Al alcanzar la confluencia en
el cultivo, se pueden observar muchas líneas celulares expresando sus aspectos
más característicos en cuanto su morfología y fisiología son más parecidas a su
estado original..
Las aplicaciones de los cultivos celulares pueden ser
tanto en la investigación básica como en la aplicada. En la investigación
básica, permiten estudiar fenómenos complejos, entre las aplicaciones más
importantes: la actividad intracelular (transcripción de ADN, metabolismo
energético), el flujo intracelular de biomoléculas (procesamiento del ARN),
Genómica, Virología, Biotecnología y ecología celular.
Así mismo el manejo in vito de células presenta ventajas las más importantes son: que
permiten un control preciso y fino del medio ambiente, una caracterización y
homogeneidad de la muestra celular y el bajo costo económico.
Por otra parte, las desventajas del
mantenimiento de una línea celular se dan por que es una técnica sensible, también
la cantidad y la inestabilidad genómica que muchas células tienen, conlleva que
afecte su velocidad de crecimiento como su capacidad de diferenciarse.
En nuestro proyecto hemos trabajado con la línea
celular tumoral humana A549 las cuales son
células alveolares de cáncer basales epiteliales de humanos. Esta línea celular
fue desarrollada por primera vez en 1972 por DJ Giard, et al. A través de la
extracción y cultivo de tejido pulmonar canceroso de un hombre caucásico de 58
años.
En la naturaleza, estas células son escamosas y
responsables de la difusión de algunas sustancias, tales como agua y
electrolitos, a través de los alvéolos de los pulmones. Si estas se cultivan in vitro, crecen como células en monocapa
adherente.
Dentro del mantenimiento de una línea celular es
indispensable su crioconservación con el objetivo de crear bancos de células
las cuales se utilizaran dependiendo de interés científico, es así que como
parte de mis objetivos fue aprender la técnica de crioconservación de la línea
celular A- 549.
La palabra griega "cryo"
significa frío. La criobiología es la
ciencia que estudia la preservación de los materiales biológicos enfriándolos a
temperaturas criogénicas. Su objetivo principal, es la conservación de células
vivas mediante la utilización de las bajas temperaturas, frenando los procesos,
envejecimiento y degeneración celular, incluidas
las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula. Generalmente
las células son congeladas entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para
disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener
en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. (Loyzaga 2011)
En farmacología y Toxicología se emplean ampliamente
los modelos basados en la reactividad de las células aisladas. (Loyzaga 2011)
Y aunque
si bien las células después de haber sido descongeladas en el laboratorio,
deben sobrevivir a un ambiente artificial en la caja, este debe ser estéril y sobre
todo debe proporcionar a las células un ambiente adecuado con los siguientes factores:
el primero que es la temperatura, como si fuese el mismo cuerpo humano donde
estas se encuentran, el factor de espacio: la caja no debe contener demasiadas
células y finalmenteel factor principal: poseer los nutrientes necesarios en el
medio suplementado, para que solo de esta forma las células puedan crecer
normalmente y evadir el comúnmente denominado“estrés celular” y sobre todo
puedan sobrevivir.
·
Materiales y Metodología:
Cámara de Flujo Laminar: Usadas para preparar productos estériles que no casan
daño alguno al operador y productos (Delgado & Díaz 2005)
Tripsina: Sirve para desasociar células por métodos químicos, La
reacción de la tripsinización se debe parar luego de dos o tres minutos con la
adición inhibidor de tripsina
inmediatamente. (Fernández 1997) para evitar el estrés célular.
PBS:
Es uno de los buffers más utilizados porque es
isotónico y no tóxico para las células. Se utiliza para diluir sustancias
utilizadas para el cultivo y para lavar los recipientes que contienen células.
Cámara de
Neubauer (Hematocitómetro Muchos
experimentos biomédicos requieren la manipulación de una cantidad conocida de
células, con el fin de lograr datos precisos, reproducibles, y estadísticamente
relevante. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica
particularmente esencial para cualquier científico biomédico. La forma más
común para contar las células es mediante el uso de un hemocitómetro - un
instrumento que lleva dos rejillas grabadas con láser, que ayudan en la
enumeración de las células de una alícuota bajo un microscopio.
Frasco de
cultivo de Roux: Disponibles en
diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la
producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión.
El azul de tripano: se usa comúnmente como colorante en microscopía (para el recuento de células).
El medio por el cual las células se encuentran dentro
y por ende crecen y dividen se conoce
como “medio suplementado”. Su composición de solución química no comprende en
su totalidad un medio basal, sino que este suele ser suplementado con otras sustancias
clave, entre ellas:
Aminoácidos esenciales, un suplemento común de
aminoácido es la conocidaL glutamina, aunque inestable en el medio se recomienda
añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado. La
usamos en una concentración del 1%.
Hormonas y factores de crecimiento: suero fetal bobino ("fetal bovine
serum FBS) que es usado en líneas más exigentes. Este suero tiene la propiedad
química de inhibir la tripsina. La usamos en una concentración del 10%.
Se añaden inhibidores del crecimiento de los
contaminantes: antibiótico- antimicótico.
(En el laboratorio de la UTPL, se suele suministrarlocuando preparan el medio
basal). Su concentración es del 1% para ser usado.
Condiciones
de cultivo.
Las línea celular fue cultivada en medio base RPMI-1640
(GIBCO) suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% (GIBCO),
antibiótico-antimicótico (100 Unidades/ml de Penicilina G, 100 µg/ml de sulfato
de Estreptomicina y 0,25 µg/ml de Amphotericina B como Funfizona) (GIBCO), 2 mM
de L-glutamina (GIBCO), Bicarbonato de sodio al 0,2% (MERCK). Los cultivos
celulares se mantuvieron en incubación a 37°C de Temperatura en una atmósfera
humidificada al 5% de CO2.
Un parámetro adicional que nos permite conocer el
crecimiento de nuestra línea celular es observar el viraje del color del medio, ya que se sabe
que cuando las células no crecen, el medio no se consume y permanece en su
color original rosa intenso, por otra parte se ha comprobado que cuando las
células están creciendo normalmente el medio tiende a acidificarse tomando un
color durazno o amarillo.
Descongelar
las células:
Antes de
iniciar cualquier operación el laboratorio, se acondiciona el área de trabajo. Esto
significa que la cabina de flujo laminar previamente debe haber estado con UV
durante 15 minutos y otros 15 minutos con flujo de aire.
En una
caja de 25 cm²,colocamos 3ml de medio suplementado. Retiramos los criotubos del
depósito de nitrógeno líquido serán transportados de forma inmediata a un baño
térmico a 37ºC, procurando que la parte
superior no quede sumergida enel mismo.
Cuando su contenido se encuentre en un estado líquido
en más o menos de 3-4 minutos, volteamos el contenido del criotubo dentro del
frasco de cultivo 25 cm², y
procedemos a homogenizar con movimientos ascendentes con el fin que las células
se distribuyan por toda la superficie.
Una vez que las células estén en el frasco de cultivo,
se comprobará el resultado de la siembra mediante observación en un microscopio
invertido.
Transcurridas
dos horas, se procederá a realizar el cambio de medio de cultivo
Cálculos
previos para el mantenimiento celular:
Previó a cualquier ensayo a realizarse con cultivos
celulares se debe llevar una planificación para saber el número aproximado de células que
vamos a necesitar para lo cual se revisa la información de la línea celular y
constatamos el periodo de réplica lo cual va sujeto al área de cultivo, es así
como obtendremos una relación entre el
número de células que necesitamos y el área del frasco de cultivo.
Para llegar a proceder con nuestros cálculos,
necesitamos saber cuántas células entran dentro de nuestros materiales de
trabajo, uno de estos es llamado “crio vial” (tubo en que se congelan las
células) en donde entran aproximadamente 1’200.000 células. En un frasco Roux (botella donde crecen las
células es suspensión) entran 7’500.000 células como máximo. La tasa de
crecimiento celular es logarítmica y se da cada 24 horas, es así que
planificamos el número inicial de nuestro cultivo.
Mantenimiento
celular:
1.
Una vez que
todos nuestros materiales mencionados y nuestro lugar de trabajo se encuentra
estériles, introducimos estos frascos limpiándolos con alcohol para no dejar
introducir agentes externos a la cámara de flujo laminar.
2.
Tomamos la
caja de cultivo que ya tiene las células descongeladas y la introducimos
limpiándola con alcohol exteriormente.
3.
Eliminamos de
la caja el medio consumido y ponemos 5ml de PBS así “lavamos la caja”.
4.
Eliminamos el
PBS con la bomba de vacío succionándolo
para dejar la caja vacía y agregamos 500 µl de tripsina, dejando que actúe durante 2 minutos.
5.
Para inhibir
la tripsina usamos medio suplementado (siempre la cantidad de medio
suplementado debe doblar a la cantidad que se usó en tripsina para que esta
enzima deje de actuar)
6.
Pasamos la
suspensión celular a un tubo Corning para
centrífuga durante cinco minutos a 1500 rpm.
7.
Durante este
periodo de centrifuga preparo el material que voy a utilizar como es el
hemocitometro con el cual realizaremos el recuento celular, este debe estar en
buenas condiciones y se lo debe limpiar siempre antes de cada uso.
8.
Luego
retiramos nuestro tubo para eliminar el sobre nadante y mantener el pellet, debemos
aspirar con cuidado el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el pellet, seguido resuspendemos el pellet
con 1ml de medio suplementado y homogenizamos.
9.
La cuantificación
del número de células por mililitro se realizó mediante el método de exclusión
con azul de tripano, contando en la cámara de Neubaüer 5 campos. Se calculó el número de células
mediante la aplicación de la siguiente fórmula:
La
finalidad de esto es responder a la pregunta ¿Cuánto es el número de células viables por ml?
10.
Cuando inserte
en el microscopio este Hemocitómetro, usar un acercamiento [40X Filtro 1
(ph1)]. Nótese que son 2 espacios de almacenamiento distintos los que tiene la
cámara de Neubauer, cada uno comprende de nueve cuadrantes y solo se cuentan
las células en los cinco espacios marcados en el presente gráfico:
11. Una vez
contados las células de los cinco espacios de los dos compartimientos del
Hemocitómetro, se saca una media de estas.
¿Cuántas
células hay en el Hemocitómetro?
Mi media fue 156.5,
mi factor de dilución 50 y dividido
para los cinco cuadrantes obtuve 1565
que al multiplicarlo por 10.000 (volumen del diámetro de la
cámara de Neubauer) me dio igual a 15’650.000
células en el Hemocitómetro.
Ecuación
final para saber cuántos µl
necesito sacar:
Para saber ¿cuántos ml debo sacar del tubo Corning hacia
mi caja? se aplica la siguiente fórmula:
·
Resultados Y Discusión:
Aprender que las células
crecen logarítmicamente. Observando su morfología correcta y verificando la
confluencia de crecimiento, reconocer si
mi cultivo se encuentra en buenas condiciones, mantenerlo libre de hongos y
levaduras, así mismo pude diferencia la apariencia celular cuando estas se
encontraban en buen estado y cuando estas se encuentran en condiciones de
estrés como por ejemplo por falta de nutrientes. Así mismo puedo reconocer si es necesario o no subcultivar, así como
habrá días en los que solamente se requiera cambiar el medio cultivo. En casos
que no se cambie el medio las células a tiempo o pertinentemente pueden estresarse y por consecuencia la tasa
de crecimiento no será normal.
Finalmente pude colaborar con un incremento de 5 nuevos
crioviales que contienen células A 549 para el banco de células del
laboratorio, así como he aprendido la importancia de un adecuado uso de los
materiales, reactivos y equipos que se emplean para estas técnicas in vitro
Conclusiones
Todas las líneas celulares son propensas a estresarse o
contaminarse para lo cual debemos evitar el mal uso de los reactivos y equipos,
se debe llevar un control diario de la morfología de las células, antes de
iniciar el trabajo se debe constatar que se cuente con el material necesario
así como estar seguro de entender las técnicas y los cálculos necesarios para
un buen trabajo.
·
Bibliografía
Castillo, G. (ed.). 2004. Ensayos toxicológicos y
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Delgado
López, N, Díaz,
J. 2005. Fundamentos de nutrición
parenteral. Ed. Médica Internacional
LTDA. 9589181929. Colombia. 106 pp
Fernández Canales, M. (ed.). 1997. Procesos de
transmodulación en el sistema nervioso, estudios "in vitro" e
"in vivo". Ediciones de la Universidad de Castilla-La Mancha, España. 58 pp
Laboratorio
de senacsa. 2001. Manual de técnicas de laboratorio para el
diagnóstico en salud animal. Tomo I · SENACSA,IICA, Paraguay. 57 pp
Loyzaga,
G. 2011. Cátedra innovación y Salud. Fundación FG-UCM.
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