ABSTRACTO
Las micorrizas
arbusculares (MA) son simbiontes benéficos para el crecimiento vegetal. Estos
biótrofos, con la finalidad de crecer y
completar su ciclo de vida, deben mantener una asociación simbiótica
estrecha con las raíces vivas de sus plantas huéspedes. Las plantas a cambio de
este beneficio, obtienen mejoras significativas en cuanto a la absorción de
nutrientes de fósforo, la producción de
hormonas de crecimiento, aumento de las proteínas, los lípidos y los niveles de
azúcares, también ayuda a las plantas a que liguen mayor cantidad de metales
pesados, toleren la salinidad, adquieran resistencia a enfermedades, e incluso ayudan
en la absorción de radionúclidos. Las MA pueden interactuar simbióticamente con
casi todas las plantas que viven en la Tierra. Se dice que se encuentran en las
raíces de aproximadamente el 80-90% de todas las especies vegetales y sus cepas
aisladas se pueden utilizar para la inoculación de especies de plantas que
podrían ser utilizadas para la rehabilitación de sitios contaminados. En la
provincia de Zamora Chinchipe, al sur del ecuador, dentro de los sectores Chinapintza
y El Pangui, se ha reportado minería ilegal y no controlada, situación que ha
puesto el suelo de tales localidades en situaciones deplorables. El objetivo principal de este estudio, fue primero poder
hacer una secuenciación para obtener la caracterización molecular de las
especies de MA (Filogenia), que se encuentran naturalmente sobre estos suelos
ecológicamente contaminados (Micorrizorremediación). Por último, como parte de
este mismo proyecto, otros dos estudios están siendo realizados paralelamente, con
la finalidad de tratar de encontrar diversas soluciones para mejorar el suelo de
este sector, tales objetivos secundarios son: medir la concentración de MA presente
en las raíces de las plantas obtenidas en sitio contaminado y, crear una
cosecha en invernadero con condiciones controladas, de plantas asociadas con hongos
micorrizógenos inoculados artificialmente, utilizando suelo contaminado para
determinar al analizar el tejido vegetal químicamente, si estas plántulas están
logrando una mejora al absorber más metales pesados de lo normal. Los tres
objetivos mencionados del estudio todavía se encuentran sin culminar y esperan
ser publicados a fines de agosto 2015.
Introducción
El término "micorrizas" deriva
literalmente de las palabras griegas myke
y rhiza, que significan hongo y raíz,
respectivamente (Wang y Qui, 2006). Según Jeffries et al. (2003) Quizás el
mutualismo más extendido y ciertamente significativo entre las plantas y los
hongos, es el de simbiosis de raíz, las mismas que tienen por nombre “micorrizas
arbusculares” o sus siglas (MA). Los efectos beneficiosos de las MA resultan de
la colonización micorrízica en las raíces, existe una mayor superficie de
absorción y como consecuencia de una mayor área de suelo expuesto para sus plantas
huéspedes, ayudan a estas a absorber
fósforo entre otros nutrientes esenciales de baja disponibilidad y a retenerlos
mejor, ayudan también a promover el crecimiento hormonal e incrementar su
contenido proteico, lipídico y de hidratos de carbono, como también en sus
niveles de aminoácidos. (Selvaraj y Chellappan, 2006). Además de esto, las MA son
consideradas componentes esenciales de la biota del suelo y además son
conocidas por mejorar la tolerancia de las plantas frente a una amplia serie de
posibles dificultades como son: la toxicidad de metales, salinidad y patógenos
que podrían afectar a las plantas que viven dentro de un suelo infectado o
contaminado (Olexa et al., 2000).
Como ya ha sido mencionado, los hongos MA,
que están entre los componentes más comunes de suelo y en la flora de la
rizosfera, son de gran interés para los científicos del suelo y del medio
ambiente, en cuanto al tema de la fito remediación y el punto de vista
ambiental. Las MA juegan un papel importante en la restauración de ecosistemas
contaminados y se utilizan cada vez más en muchos países para mejorar la
nutrición de las plantas y la fertilidad de las tierras degradadas. Como los MA
se están convirtiendo disponibles en el mercado, su uso también ofrecerá nuevas
vías para reducir la contaminación de la agricultura (Giasson et al., 2008).
La contaminación de la Biosfera por metales
pesados ha acelerado dramáticamente durante las últimas décadas debido a la
minería, la fundición, la fabricación, el tratamiento de los suelos agrícolas
con agroquímicos, etc. (He et al., 2005). Un estudio realizado por Selvaraj et
al. (2004) captó el efecto directo que tenían las esporas provenientes de un
hongo MA en dos plantas, Phyllanthus
niruri y Ecliptica alba, y reveló
que las MA eran más beneficiosas para el crecimiento vegetal. Se observó que a
pesar de la alteración del crecimiento, las plantas inoculadas y directamente
asociadas con MA fueron eficientes respecto a tolerar ecosistemas en peligro. Las
dos plantas hospedadoras inoculadas experimentales mostraron más captación de K
+ y Ca2 + en las raíces en comparación a la pobre captación de las plantas no inoculadas.
De este modo, a través de la ayuda de los hongos MA, las probabilidades para
sobrevivir para la vegetación son mayores en los ecosistemas perturbados de una
gran manera.
METODOLOGIA
I: Caracterización molecular (Secuenciación,
Filogenia) de las especies de MA provenientes de suelos ecológicamente
contaminados.
Ø Sitio
de Estudio
Las
muestras de suelo y de raíces fueron recolectadas en dos sectores: Chinapintza
y El Pangui, ambos pertenecientes a Zamora Chinchipe, se sabe que el suelo de
Chinapintza está contaminado por pequeñas actividades mineras, mientras que El
Pangui que queda a 5Km de la de Chinapintza, es un sitio naturalmente
contaminado.
Ø Recolección
de las Raíces
Se trabajó con 6 especies de plantas, de las cuales
se recolectaron solo 3 réplicas por especie, en total 18 réplicas llevadas al
laboratorio (cabe decir que es muy difícil recolectar plantas en un suelo tan
contaminado). Estas 6 especies fueron: Erato
polymnioides, Miconia sp, Medinilla sp, Axonopus compressus, Colocasia sp, Cyathea
sp.
Ø Análisis Molecular de las esporas
encontradas en raíces con MA.
Se extrajo el ADN de las raíces de todas las
muestras. Para obtener un producto de PCR de MA, se utilizaron los primers AML1 y AML2.
Este producto de PCR fue utilizado para el proceso de Clonning , en el cual se
utilizó el vector PCR TOPO Zero BLUNT. Después de amplificar por medio del
proceso de clonación, para poder confirmar estos productos de PCR, se tuvo que
realizar un procedimiento de Check clonning.
El vector de PCR fue usado para check clonning y
para secuenciación. Las colonias de bacterias del clonning fueron incubadas a
37°
por 12 horas en una noche en Kanamicina.
Para la PCR del check clonning se utilizó los
primers M13 foward y M13 reverse, esto fue para saber cuál de las colonias
fueron las que sobrevivieron en kanamicina contenían el inserto, por ende,
saber cuales son las que importan. Para esto se realizó una reacción de PCR y electroforesis
para confirmación de estas. En la electroforesis, 800pb fue la altura del
marcador para saber qué muestras eran los clones (positivos). Al final, de cada
de las 18 répilicas de todas las raíces colectadas, se hizo unas 50
electroforesis totales. El sexto paso fue realizar una purificación del ADN.
Finalmente se preparó un plato con las muestras que presentaron clones
positivos para ser enviadas a secuenciar.
II:
Medición de concentración de MA en las
raíces de las plantas obtenidas.
Ø Tinción
de raíces para observar la colonización micorrízica.
Habiéndose
colectado las raíces del sitio de muestreo, para entender y analizar el
porcentaje de micorriza que estas raíces poseían, se utilizó la metodología de
Philips y Hayman (1970), donde las raíces se las somete a un clareo y
tinción.
Primero se lavaron las
raíces para eliminar los residuos de tierra y se enjuagó con agua. Segundo, se
sumergieron las raíces en KOH al 10% a 90°C por una hora o a 120°C por 15
minutos en autoclave. El tercer paso fue remover el KOH para enjuagar las
raíces con agua algunas veces. El paso siguiente fue sumergir en agua oxigenada
alcalinizada las raíces durante 10-30 porque todavía se encontraban
pigmentadas. Enjuagamos nuevamente las raíces con agua normal. El penúltimo
paso fue sumergir las raíces en HCL al 1% por cinco minutos y teñimos las
raíces en una solución de glicerol ácido con azul de tripano a 90°C por toda la
noche a 120 °C. Finalmente, el último paso fue descargar la solución colorante
para mantener las raíces en agua a temperatura ambiente.
Fig 2. Proceso de identificación de esporas individuales a partir de MA aisladas.
III:
Análisis de metales pesados por medio de tejido de raíces provenientes de
cosecha en invernadero.
La una última parte de esta investigación, es enfocada
a complementar el objetivo principal, al tratar de analizar si la condición del
suelo contaminado puede mejorar gracias a la absorción de metales pesados por medio
de plantas (semillas obtenidas de especies de Zamora Chinchipe), para esto, se
debe inocular hongos micorrízicos (aislados) adentro de estas plántulas, y así,
por medio de suelo obtenido del sitio original (Chinapintza), determinar si está
surgiendo algún efecto positivo, y esto se realiza mediante un análisis químico
de las raíces de estas plantas, luego que hayan transcurrido dos meses en
cosecha en invernadero. Finalmente, se asesora cuál de las especies está
absorbiendo más metales pesados con la ayuda de esta asociación micorrízica que
fue colocada por ayuda nuestra.
Ø Preparación
de las masetas con distintos tipos de suelo.
Primero, se preparó 4 tipos distintos de masetas que contenían un
distinto tipo de suelo cada uno, y en el cuál, cada tipo de suelo incluía sus
35 réplicas.
Fig 1.
Diseño investigativo para el análisis de
tejido vegetal. A cada tipo de maseta se le sembró semillas de Erato polymnioides. A. — Suelo esterilizado, Control
Positivo; B— Suelo
no esterilizado, Control Negativo; C— Suelo estéril con MA, Control
positivo + MA; D— Suelo no esterilizado, Control negativo + MA. Esta cosecha de
plantas experimentales tuvo una duración de 2 meses.
Ø Cosecha
de semillas en invernadero.
Antes de sembrar las semillas, de los cuatro tipos
de suelo separados, se autoclavó dos tipos de suelo en fundas, esto para
estudiar las bacterias como una posible variable, ya que se sabe que su
presencia a veces representa un problema.
Una vez obtenido cuatro tipos de suelo distintos
(dos estériles y dos no estériles), se utilizó semillas de Erato polymnioides, provenientes del sector minero de Zamora
Chinchipe, para ser sembradas en cada una de estos cuatro tipos de suelo. No
necesariamente la inoculación de hongos MA se la realizaría en todos los tipos
de suelo, sino en dos.
Ø Método
de Inoculación de MA bajo condiciones controladas.
Una vez, colocado los distintos tipos de suelo y las semillas en las
masetas, se tuvo que adquirir hongos micorrízicos MA aislados. Se importó un
tubo de MYKE® PRO Mycorrhizae. Estas son esporas aisladas de micorriza, y
fueron aplicadas dentro de las masetas en solo dos tipos de suelo (suelo
estéril y suelo no estéril), para una mejor explicación ver en la figura 1. Al aplicarlas, se sabe que estas alianzan hongos en las plántulas y estimulan su
crecimiento y desarrollo de la raíz, aumentando la tolerancia al estrés frente
a metales pesados.
Fig 2. Proceso de identificación de esporas individuales a partir de MA aisladas.
Fig 2. Proceso de identificación de esporas individuales a partir de MA aisladas.
Ø Análisis
químico de las raíces.
Luego de la siembra de las plantas experimentales en
suelo contaminado, y después de un riego normal durante 60 días, crecieron unas
pocas primeras plántulas, sobre todo las semillas que estaban en suelo
esterilizado, más la ayuda de los hongos micorrízicos MA inoculados por
nosotros.
Actualmente se está analizando los tejidos de raíz
para análisis de metales pesados (Pb, Ca, Cd, Cr, Al).
RESULTADOS
Parte de los resultados obtenidos en el presente
estudio, lamentablemente solo puede ser expuesto uno por contratos legales con
la SENESCYT.
I: Caracterización molecular
(Secuenciación, Filogenia) de las especies de MA provenientes de suelos
ecológicamente contaminados.
Estos resultados
filogenéticos no pueden ser todavía revelados por acuerdos legales con la SENESCYT
al ser un proyecto que todavía debe cumplir con un mes de duración, está
prohibido su exposición antes del período establecido.
II:
Medición de concentración de MA en las
raíces de las plantas obtenidas.
Las muestras de suelo y de
raíces fueron recolectadas en dos sectores: Chinapintza y La Pangui, ambos
pertenecientes a Zamora Chinchipe, se sabe que el suelo de Chinapintza está
contaminado por pequeñas actividades mineras, mientras que la de El Pangui que
queda a 5Km de Chinapintza, es un sitio naturalmente contaminado.
Los resultados por parte de
un análisis del departamento de química de la UTPL para los principales metales
pesados encontrados en las raíces las plantas obtenidas en ambas localidades,
fueron en su mayoría de: Al, Cd, Cr, Cu, Pb y Zn. La tabla 1 muestra sus valores.
III:
Análisis de metales pesados por medio de tejido de raíces provenientes de
cosecha en invernadero.
Estos valores aún están
siendo investigados por el departamento de química de la UTPL y sus resultados
no pueden ser todavía expuestos al ser un proyecto vinculado con la SENESCYT
que todavía debe cumplir con un mes de duración.
Al
|
Cd
|
Cr
|
Cu
|
Pb
|
Zn
|
|
Chinapintza
|
7.922,37 ppm
|
4,25 ppm
|
8,05 ppm
|
42,35 ppm
|
829,4 ppm
|
172,82 ppm
|
La
Pangui
|
7536.12 ppm
|
2,13 ppm
|
11,65 ppm
|
26,71 ppm
|
498,72 ppm
|
87,94 ppm
|
Tabla 1. Resultados
del análisis químico para los metales pesados obtenidos de ambos sitios de
estudio de Zamora Chinchipe.
DISCUSIÓN
En cuanto al análisis
molecular para las raíces obtenidas, es bueno saber que aunque éstas contengan sobre todo material genético proveniente de la planta y solo
poco material genético del hongo micorrízico, de todas formas aunque sea poca
la cantidad, esta es la forma de trabajar en estos tipos de experimentos; muy
poca cantidad de material genético del hongo micorrízico es lo suficiente para que
sea amplificado y secuenciado luego.
Los resultados de
investigación del objetivo II, demuestran claramente la absorción de metales
pesados por parte de asociación hongo-planta es superior en el suelo de
Chinapintza dado que esta es una zona industrializada.
En el objetivo de
investigación III, Chinapintza fue el único sitio previsto para obtener suelo
contaminado para usarlo en el experimento de invernadero, dado que es un suelo
más contaminado que El Pangui.
Cuando se quiere detectar y
medir la colonización micorrízica en raíces, un baño de agua a 90°C es
apropiado para mantener bien las muestras.
CONCLUSIONES
Luego de que los resultados
de este primer año se publiquen a finales de Agosto, dando respuesta a las
incógnitas de ¿cuáles son las especies de MA presentes y que especie de planta
asociada con MA absorbe más metales pesados?; Selvaraj Thangaswamy, al haber
trabajado desde 1991 en Micorrizorremediación, explica que inclusive sabiendo
esto, no es correcto y peor prudente declarar a partir de estos resultados, que
el suelo de las dos localidades de Zamora Chinchipe podrían ser remediados en
un intervalo de tres años o menos, sin importar que se requiera a una
propagación masiva por ayuda humana de la especie que mejor se relacionó con el
MA y mayor metales absorbió en el
invernadero.
La solución es que se
necesitan más o menos dos o tres años de investigación a partir de los
resultados de esta publicación, para que se comience a saber si en primer lugar
hay un posible remedio al suelo altamente dañado por la industrialización y
minería no controlada de aquellos sectores.
Por último, se sabe desde
luego que ahora mismo, el suelo de Chinapintza es el suelo más contaminado en
que mi tutor ha trabajado hasta el momento, y esto se debe posiblemente a la
falta de iniciativa de medidas regulatorias y de penalización que se deben
aplicar para los que están acabando con el suelo y por ende con la flora de
estos dos sectores de Zamora Chinchipe.
REFERENCIAS
Giasson, P., Karam, A., &
Jaouich, A. (2008). Arbuscular mycorrhizae and alleviation of soil stresses on
plant growth. In Mycorrhizae: Sustainable agriculture and forestry (pp.
99-134). Springer Netherlands.
He, Z. L., Yang, X. E., &
Stoffella, P. J. (2005). Trace elements in agroecosystems and impacts on the
environment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 19(2),
125-140.
Jeffries, P., Gianinazzi, S.,
Perotto, S., Turnau, K., & Barea, J. M. (2003). The contribution of
arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant health and
soil fertility. Biology and
fertility of soils,37(1), 1-16.
Olexa, T. J., Gentry, T. J., Hartel,
P. G., Wolf, D. C., Fuhrmann, J. J., & Reynolds, C. M. (2000). Mycorrhizal
colonization and microbial community structure in the rhizosphere of annual
ryegrass grown in pyrene‐amended soils. International Journal of
Phytoremediation, 2(3),
213-231.
Phillips, J. M., & Hayman, D.
S. (1970). Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions
of the British mycological Society, 55(1), 158-IN18.
Selvaraj, T., Padmanabhan, C.,
JEONG, Y. J., & KIM, H. (2004). Occurrence of vesicular-arbuscular
mycorrhizal (VAM) fungi and their effect on plant growth in endangered
vegetations. Journal of
microbiology and biotechnology, 14(4),
885-890.
Selvaraj, T., & Chellappan, P.
(2006). Arbuscular mycorrhizae: a diverse personality. Journal of Central European
Agriculture, 7(2),
349-358.
Wang, B., & Qiu, Y. L. (2006).
Phylogenetic distribution and evolution of mycorrhizas in land plants. Mycorrhiza, 16(5), 299-363.
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